在诊断和治疗领域，对能够在复杂环境（如高有机溶剂、高盐、酸或碱）中保持稳定性的抗体有着迫切需求。兔源单克隆抗体（RmAbs）因其具备高亲和力和高稳定性，成为首选。然而，传统的针对小分子靶点的研发平台在效能上存在一定限制。

　　氯霉素（CAP）是一种抗菌剂，存在于动物源性食品中的氯霉素对公共健康构成了重大威胁。中国农业大学动物源性食品安全检测北京重点实验室的王战辉团队在2022年发表于《Analyst》的一篇文章中，介绍了他们利用基于纳米孔的间接竞争性筛选技术（CSMN），仅在20.6小时内成功筛选出靶向氯霉素的兔源单克隆抗体分泌细胞（ASC）。通过结合分子生物学技术，该团队首次在5.8天内成功获得了一个靶向氯霉素的兔源单克隆抗体（RmAb）。这一抗体在检测真实生物样品中的氯霉素时，展现出样本前处理更简单、检测时间更短、重复性更佳以及灵敏度更高的优势。

　　与靶点为蛋白质的抗原不同，氯霉素（CAP）分子非常小，因此需要与牛血清白蛋白（BSA）耦联后作为免疫原进行动物免疫。然而，耦联后不仅会产生针对氯霉素的抗体，还会生成针对连接子（linker）和BSA的抗体。为获得特异性靶向氯霉素的抗体，研究团队采用了下图所示的CSMN平台，对特异性靶向氯霉素的抗体分泌细胞（ASC）进行了筛选。

　　②加入分离的脾细胞与PE标记的兔二抗混合液，静置10min使ASCs沉降到纳米孔里达到分离ASCs的目的

　　③该纳米孔板置于37度、5% 二氧化碳环境中培养，ASCs会分泌抗体，与包被在纳米孔表面的CAP-BSA结合，再与悬液中PE标记的二抗结合产生荧光信号。4h后如在纳米孔内检测到增强的荧光信号，说明孔内有靶向CAP-BSA的ASC

　　④4h时向孔内加入CAP，会与纳米孔表面CAP-BSA中的CAP竞争分泌的抗体，如4-8h荧光信号显著下降，则该纳米孔内的ASC是CAP特异性的ASC，如4h后信号仍很强则是靶向连接子或BSA的ASC

　　⑤最后使用赛多利斯的CellCelector全自动无损细胞分离系统结合直径为20μm的玻璃毛细管轻柔地将该ASC挑出，裂解后分离其mRNA先反转录，利用特定的引物扩增RmAb的轻、重链可变区，测序，真核表达得到靶向CAP的RmAb

　　从利用纳米孔板使ASCs分离为单个ASC，到连续成像追踪抗体的分泌，最后以抗体荧光信号改变作为筛选条件，把靶向CAP的ASC挑取出来，整个流程均由CellCelector全自动无损细胞分离系统一台设备在20.6小时内完成，充分体现了CellCelector全自动无损细胞分离系统的全能和高效。

　　图2A展示了三种不同抗体分泌细胞（ASCs）在明场下的图像，以及0-8小时内针对兔源单克隆抗体（RmAbs）的荧光信号变化及对应的荧光强度定量结果。具体来说，图2A显示了纳米孔中靶向氯霉素（CAP）的单个ASC细胞在0-8小时内分泌的RmAbs荧光信号变化；图2D展示了在4小时时加入CAP前后的荧光信号变化模式，由于竞争作用导致孔内荧光信号减弱的情况，并在图2E中进行了各时间点荧光信号强度的统计，显示出先上升后下降的趋势。与此对米乐M6 米乐平台比，靶向BSA的ASC分泌的RmAbs荧光信号持续增强（图2B、F和G）；而不靶向CAP或BSA的ASC未检测到抗体信号（图2C、H和I）。

　　赛多利斯CellCelector全自动无损细胞分离系统提供了适用于不同实验目的的纳米孔板，每个纳米孔板包含十万到数百万个纳米孔。鉴于兔脾细胞的直径约为8-13μm，为提高单细胞分离率和挑取率，在实验前对四种不同尺寸的纳米孔板（六边形的H100、UFO形的U40、UFO形的U25和方形的SIEVEWELL）进行了单细胞率测试，纳米孔尺寸范围从20μm到100μm不等。结果表明，U25纳米孔板的单细胞率最高（图2A）。对于U25纳米孔板，每孔接种的细胞数也需进行优化。图2C-E展示了每孔接种细胞数分别为5E3、1E4和2E4时的效果。随着接种细胞数的增加，空孔率降低，但每个纳米孔中含有多个细胞的比例也随之增加，最终发现1E4的细胞密度最为合适。

　　CellCelector全自动无损细胞分离系统提供各种直径的挑头，用于挑取不同大小的贴壁或者非贴壁细胞，也可以快速挑取在半固体中培养的菌落和类器官等样本。

　　在挑取前，根据纳米孔内明场图片确认是否为单个ASC。然后，依据分泌抗体荧光信号的变化确定靶向CAP的ASC，进而进行挑取。挑取后，再次对该纳米孔成像（红线圈选区域），CellCelector全自动无损细胞分离系统利用其成像功能为筛选全流程的准确度保驾护航。

　　下图展示了王老师团队同年发表在《Food and Chemical Toxicology》上的研究成果[2]，利用CSMN平台筛选靶向另一种与食品安全相关的小分子——瘦肉精（RAC）。图中A、B、C分别显示了靶向RAC、BSA及其他靶点的抗体分泌细胞（ASC）在加入RAC前后不同时间点纳米孔内抗体荧光信号的动态变化。最终筛选出的RAC特异性兔源单克隆抗体（RmAb）能够在高尿素环境中检测RAC水平。

　　一年两篇文章利用CellCelector 高效筛选到靶向两个小分子的RmAb，是因为CellCelector细胞分离系统具有以下优势：

　　②Nanowell纳米孔板技术，每个纳米板含有十万到数百万个纳米孔，实现更高通量的细胞筛选

　　⑤用于自动调整毛细管高度的SurePick™ 技术，在挑选过程中对毛细管高度进行动态调整，允许从高度不同或半固体体系中进行高效的全自动挑选

　　⑥全流程存档记录及质量控制，完全自动化的质量控制过程，包括拣选前后的图像、拣选/失败报告和数据/图像输出

　　⑦挑取对象广，适用于米乐 登录入口贴壁细胞，悬浮细胞或半固体培养基中的细胞、菌落以3D细胞团的挑取

　　《基于图像的全自动单细胞及克隆筛选和分离》应用手册介绍了如何利用CellCelector Flex 全自动无损细胞分离系统与Nanowell 纳米孔阵列相结合，快速高效地评估和验证克隆。联系赛多利斯获取手册。